實時熒光定量PCR（簡稱qPCR）是指在PCR反應體系中加入熒光化學物質，利用熒光信號積累實時監測PCR擴增産物並進行定量分析的方法。根據所用熒光化學物質的不同，qPCR可分爲熒光染料法（SYBR Green Ⅰ法爲代表）和熒光探針法（TaqMan法爲代表）。

SYBR Green Ⅰ染料法因具有使用簡便，價格便宜等優點而被廣泛使用。但其最大的缺點是缺乏特異性，即染料可以與任何dsDNA結合。因此，qPCR反應中有非特異性擴增産物的出現會增加熒光值，影響定量結果的准確性，而TaqMan探針法的出現很好地解決了染料法非特異性的問題。下面，我們一起來了解一下TaqMan探針法qPCR的基本原理及其主要應用。

PART 01

 

TaqMan探針法qPCR原理

 

 

 

TaqMan探針法qPCR是使用TaqMan熒光探針進行熒光檢測的方法。其基本原理是PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。開始時，探針完整地結合在DNA任意一條單鏈上，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'核酸外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而發出熒光，切割的熒光分子數與PCR産物的數量成正比，因此，通過檢測PCR反應體系中的熒光強度可以達到檢測PCR産物擴增量的目的。

 

 

PART 02

 

TaqMan探針法qPCR優點

 

 

 

 

 1   特異性高、定量准確

 

從原理可以看出，熒光探針只與目的序列結合，理論上探針法的熒光信號只來源于目的序列，即不受非特異性産物的影響，因此，TaqMan探針法qPCR的特異性非常高，定量准確。

 

 

 2   實驗耗時短

 

因探針法qPCR的高特異性，故無需再設置熔解曲線檢測擴增産物的特異性如何，大大縮短了實驗時間。

 

 

 

 3   兼容多重反應

 

不同波長的熒光報告基團可以標記不同的探針，因此可以在同一個反應體系中利用不同熒光標記的探針同時檢測多個靶標，達到節省實驗成本的目的。

 

 

 

PART 03

 

TaqMan探針法qPCR主要應用

 

 

正是由于上述優點，TaqMan探針法qPCR已被廣泛地應用于科學研究和生産實踐之中。有基礎生物學研究、食品檢測、醫學檢測與診斷等,尤其是在醫學檢測和診斷方面得到了大力地推廣。因此本文重點介紹其在醫學檢測與診斷方面的應用。

 

 1   核酸定量分析

 

Taqman qPCR技術可對傳染性疾病進行定量定性分析，包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。

 

 2   基因表達差異分析

 

在現代生物醫學的許多研究領域，從基礎科學研究到藥物研究的實際應用，檢測基因表達情況都是基本的也是很重要的工作。Taqman qPCR技術可比較經過不同處理(如藥物處理、物理處理、化學處理等)樣本之間特定基因的表達差異，特定基因在不同時相的表達差異。

 3   基因型/等位基因分析

 

單核苷酸多態性（SNPs）是由DNA序列中同一個位置上的堿基對的常見替換造成的個體DNA序列差異。SNP在人類基因組中數量較多，發生頻率較高，檢測單核苷酸多態性對于研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應有著重要的意義。

 

與傳統基因型分析方法相比，Taqman qPCR技術具有高效率，低交叉汙染等多方面優勢，已成爲SNP分型應用中最常用、最便捷的方法之一。

 

 4   藥物開發研究

 

在新藥的開發過程中，快速了解藥物對疾病進程的影響可以爲新藥開發節約大量的人力、時間和資金。

與以前所用的Elisa等方法相比，TaqMan qPCR技術可以快速、准確、靈敏地測定血液或組織中病原體的含量，爲比較不同配方的療效、用藥量、用藥時間等提供快速、准確的評價。

 

 5   無創産前檢查

 

到目前爲止，人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過産前診斷，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發生。

例如爲減少X連鎖遺傳病患兒的出生，可從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用TaqMan qPCR檢測其Y性別決定區基因。此外還可以通過TaqMan qPCR對孕婦弓形蟲，梅毒等進行檢測，這對找出不明原因流産和習慣性流産的病因提供有力的幫助，大大提高優生優育。

 

 6   腫瘤基因檢測

 

盡管腫瘤發病的機理尚未清楚，但相關基因發生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。

 

TaqMan qPCR是一種有效的腫瘤前期檢測及伴隨診斷技術，涵蓋癌症惡性腫瘤的預防及治療。它不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以准確檢測癌基因的表達量。

目前用此方法已進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。

 

 

 7   病原體檢測

 

Taqman qPCR可以對多種病原體（如人類乳頭瘤病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒及非洲豬瘟病毒）進行定量測定。該技術對病原體的檢測解決了免疫學檢測的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態，適用于傳染病早期的大規模確診。

 

Taqman qPCR還可對病毒分型，例如可以鑒定特殊的HPV型別以及變異株，並對其進行針對性的處理，更有效預防宮頸癌。

此外，Taqman qPCR還可確定病毒載量。在抗病毒藥物治療監測的過程中，病毒載量是判斷藥物療效的重要指標。如HIV的藥物載量測定需通過Taqman qPCR技術來測定血液中HIV RNA的量，通過藥物載量的高低變化可幫助判斷HIV藥物效果。

 

 

PART 04

 

翌聖生物Taqman qPCR Mix在非洲豬瘟病毒檢測的應用

 

 

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染家豬或野豬引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，其發病率和死亡率可達100%，嚴重危害著全球養豬業，造成難以估量的經濟損失。

 

目前非洲豬瘟沒有疫苗和有效的治療手段，qPCR法是OIE推薦使用的非洲豬瘟常規診斷的重要工具，也是中國在現階段非洲豬瘟流行情況下首選的檢測技術。

 

翌聖生物作爲深耕于上遊生命科學領域酶制劑的供應商，長期爲IVD企業提供高品質、高性價比的原料（含可凍幹原料），積極應對非洲豬瘟疫情，助力非洲豬瘟高效檢測。

 

 

Hieff Unicon® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix（Cat#11211）

2×Mix預混合試劑，含有基因改造的抗體法熱啓動Taq酶及深度優化的多重反應緩衝體系，可極大地提高擴增靈敏度和特異性。

産品特點：

 

• 優異的擴增靈敏度： 3 copies/反應可穩定檢出

 

• 超強的存儲穩定性：4℃、25℃、37℃放置7天，反複凍融50次均性能穩定

 

• 精密度高：CV＜1%

 

• 多平台適用：適用于市售各種熒光定量PCR儀

 

• 支持多重檢測：每孔反應至多可檢測4-5個靶標

部分性能展示：

 

超高靈敏度，3 copies/反應穩定檢出

 

 

PART 05

 

産品信息

产品类型	产品描述	产品名称	货号
探针法qPCR试剂	超高灵敏度	Hieff Unicon® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix	11211ES
	全预混稳定性优化版（含UDG）	Hieff Unicon® C55P1 TaqMan Multiplex qPCR Master Mix (UDG plus)	13171ES
	高GC含量扩增子扩增	Hieff Unicon® TaqMan multiplex qPCR master mix	11208ES
	可冻干试剂盒	Hieff Unicon Lyo-TaqMan Multiplex qPCR Kit	13695ES